熒光定量PCR檢測

　　實驗介紹實時熒光定量PCR（real time PCR，RT-PCR）就是通過對PCR擴增反應中每一個循環時產物的熒光信號的實時監測從而實現對起始模板定量（即絕對定量PCR）及定性（即相對定量PCR）的分析，每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化檢測產物量的變化，并據此推斷目的基因的初始量。絕對定量PCR不僅能測定目的基因在兩個或多個樣本中含量的相對比值，還能測定目的基因在每個樣本中的具體拷貝數；相對定量PCR則只能測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，不能知道它們在每個樣本中的拷貝數。依據目的基因檢測難易度可進行TaqMan檢測與SYBR檢測，前者能準確區分單個堿基的差別獲得最為準確的定量結果，但是其探針合成成分較高，而對于序列差別較大的基因，SYBR檢測不僅準確更為廉價。

 

　　先進儀器： ABI系列儀器（ABI-Step One Plus qPCR儀、ABI-2720 PCR儀），高精度Eppendorf 8道電動移液槍

 

　　Stepone plus qPCR儀：具有時間省、靈敏度高、準確性好和線性范圍寬等優點。

 

　　嚴格質控： 預實驗檢測引物與模板結合特異性，優化實驗條件，并通過嚴格的對照實驗保證結果準確性，樣本全程干冰或液氮運輸；保證三次重復的CT值≤0.5

 

　　頂級試劑： 頂級品牌Invitrogen等試劑、ABI原裝PCR反應板和膜

 

　　服務流程： 核酸提取及質量分析、預實驗條件優化、正式實驗樣品四次重復檢測、實驗報告包含數據分析、擴增曲線、融解曲線（注：公司提供儀器原始數據及軟件，保證絕無修改）

 

　　樣品要求：盡可能新鮮和足量的組織（＞50-100mg）、細胞樣品106以上等，對于樣本量很少或極少（25-105細胞或者約10mg組織），其他請事先咨詢。

 

　　交付結果：實驗報告，樣本返還

 

　　質量保證：客觀、公正、可信數據結果

 

　　交付時間：大約5-10個工作日（根據預實驗、樣本數量情況決定）

 

　　服務項目： 相對定量qPCR檢測（SYBR Green/TaqMan探針法）及標準品制備

 

　　絕對定量PCR檢測及標準品制備

 

　　qPCR引物設計合成、TaqMan探針法設計合成

 

　　服務流程1、 依據客戶提供的基因ID或基因名稱設計合成引物（含驗證）

 

　　2、 標準品制備:只針對于絕對定量，相對定量多種內參可供選擇（mRNA qPCR檢測：β-actin，GAPDH或客戶提供特異性內參；microRNA qPCR檢測：以U6為內參）

 

　　3、 RNA提取及RNA質量分析：采用Invitrogen的TRIzol 進行裂解提取，RNA提取質量有瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計雙重質控

 

　　4、 逆轉錄：嚴格按照fermentas的反轉錄試劑盒要求抽取質控合格的RNA，并且可提供oligo(dT)、隨機引物、基因特異性引物以及混合引物幾種模式進行反轉錄，以最大程度的確保反轉錄酶的反轉效率

 

　　5、 預實驗驗證樣品和引物：依據客戶選定內參及基因，對客戶全部樣本內參及個別樣本基因進行驗證，以確保樣本的反轉錄情況及基因的設計

 

　　6、 正式實驗：在以上所有質控合格的情況下，每個樣本每個基因進行四個復孔的重復檢測，確保至少提供三個復孔Ct≤0.5的數據

 

　　7、 實驗報告：提供詳細的實驗報告，包括RNA提取電泳圖、擴增曲線、溶解曲線及數據結果分析

 

　　樣本要求細胞（≥106個）：必須是活細胞，貼壁或懸浮均可

 

　　組織（≥50mg）:盡量新鮮并且切取之后立即置于液氮或-80℃保存

 

　　石蠟切片（≥10張）：厚度10-20μm，石蠟組織塊或固定組織均可

 

　　全血（2ml以上）：抗凝管4℃運輸，短期保存，分離后血清亦可

 

　　以上樣本依據提取情況可進行1-10個基因的檢測

 

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